Modelagem e otimização de classificação de nanoporos imunomagnéticos paralelizados para isolamento específico de marcadores de superfície de vesículas extracelulares de meios complexos
Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13292 (2023) Citar este artigo
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O isolamento de subpopulações específicas de vesículas extracelulares (EVs) com base na expressão de marcadores de superfície representa um desafio significativo devido ao seu tamanho em nanoescala (<800 nm), à sua expressão heterogênea de marcadores de superfície e ao grande número de EVs de fundo presentes em amostras clínicas (1010–1012 EVs/mL no sangue). A classificação nanomagnética altamente paralelizada usando chips de nanoporos magnéticos gravados em trilha (TENPO) alcançou uma classificação imunoespecífica precisa com alto rendimento e resiliência ao entupimento. No entanto, ainda não houve um estudo sistemático dos parâmetros de projeto que controlam as compensações no rendimento, na recuperação de EV alvo e na capacidade de descartar EVs de fundo nesta abordagem. Combinamos simulação de elementos finitos e caracterização experimental de chips TENPO para elucidar regras de projeto para isolar subpopulações de EV do sangue. Demonstramos a utilidade desta abordagem reduzindo o fundo do dispositivo> 10x em relação aos projetos publicados anteriormente, sem sacrificar a recuperação dos EVs alvo, selecionando o diâmetro dos poros, o número de membranas colocadas em série e a taxa de fluxo. Comparamos EVs isolados de TENPO com aqueles de métodos padrão-ouro de isolamento de EV e demonstramos sua utilidade para ampla aplicação e modularidade, visando subpopulações de EVs de múltiplos modelos de doenças, incluindo câncer de pulmão, câncer de pâncreas e câncer de fígado.
As vesículas extracelulares (EVs) são partículas membranosas em nanoescala (<800 nm) contendo cargas de ácidos nucleicos e expressando proteínas de superfície que refletem suas células de origem1. Devido às suas múltiplas cargas e à sua capacidade de contornar barreiras anatômicas, como a barreira hematoencefálica, para circular em fluidos corporais periféricos, como sangue (1010–1012 EVs/mL)2 e urina (1010 EVs/mL)3, os EVs tornaram-se uma fonte promissora de biomarcadores para o diagnóstico e caracterização de múltiplos tipos de câncer4,5,6,7,8,9, bem como em outros contextos de doenças, incluindo lesão cerebral traumática10 e doenças infecciosas11. Além disso, os VEs desempenham um papel mecanicista em processos biológicos, como disseminação metastática12 e interações tumor-imunes no câncer13, bem como patologias incluindo lesão cerebral traumática14, doença autoimune15 e parada cardíaca16.
Atualmente, o estudo dos VEs, e o seu potencial para diagnóstico e terapêutica, são travados por tecnologia que não foi concebida para abordar a sua combinação única de tamanho, complexidade e quantidade em nanoescala em bioespécimes. A alta concentração de EVs no sangue representa um desafio particular para os investigadores que buscam diferenciar uma subpopulação específica de EV de outras subpopulações de EV, bem como outras partículas não-EV, como restos celulares na mesma faixa de tamanho (“background” não relevante). . Os métodos atuais de isolamento de EV padrão-ouro, como ultracentrifugação, kits de precipitação comerciais (Thermo Fisher, System Biosciences) e cromatografia de exclusão de tamanho, não possuem a seletividade do marcador de superfície e o rendimento para classificar com precisão as subpopulações de EV .
Da mesma forma, métodos previamente estabelecidos para classificação de células por marcadores de superfície são incapazes de medir EVs em nanoescala ou atingir o rendimento para processar o grande número de EVs normalmente encontrados em amostras clínicas. Por exemplo, processar ~ 1011 EVs em 1 mL de sangue não seria viável para citometria de fluxo celular de alto rendimento. Os citômetros de fluxo de nanopartículas típicos classificam a uma taxa de ~ 1.000 contagens/segundo18, exigindo ~ 3 anos para classificar 1 mL de sangue, enquanto mesmo os mais recentes sistemas de citometria de fluxo subcelular classificam a ~ 60.000 eventos/segundo19 exigiriam 19 dias para 1 mL de sangue. Este desafio é amplificado pela baixa expressão absoluta de proteínas de superfície em EVs em comparação com células devido ao aumento dramático da área de superfície de uma célula de ~ 10 µm em comparação com um EV <800 nm, produzindo assim sinais fluorescentes abaixo do nível de detecção para sistemas comerciais de citometria de fluxo20. Em resposta a esse desafio, várias abordagens microfluídicas foram desenvolvidas usando tamanhos de recursos em micro/nanoescala de tamanho EV para realizar classificação EV baseada em tamanho ou marcador de superfície com precisão. No entanto, limitações como a exigência de nanofabricação complexa4,21,22, baixos volumes máximos de entrada23,24, dependência de um único alvo de biomarcador molecular25 ou baixo rendimento de amostra21 dificultaram a aplicabilidade do tamanho microfluídico ou da classificação EV do marcador de superfície.